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吳邊研究員團隊發表Nature Catalysis封面文章:計算賦能微生物構筑合成生物學底層砌塊

作者: 發布時間:2021.05.04 文章來源:

  微生物酶是大自然饋贈人類的珍貴寶藏。由酶驅動的生化反應網絡奠定了生命活動的核心基礎,對微生物酶的進化與機制研究可為解答生命起源和生物代謝路徑演化等重大科學問題提供線索。豐富的酶資源還賦予了微生物變相萬千的物質轉化能力,為藥物、能源、新材料等重大產品的精準合成與綠色制造提供了寶貴的可選方案,也是人工創造生命的必要基礎。 

  作為最基礎的生命砌塊,二十種天然氨基酸共同構筑了地球上繽紛多彩的生命體系。但天然氨基酸所攜有的功能基團變化有限,限制了人工蛋白質設計和藥物應用的發展。近年來,非天然氨基酸的引入拓展了傳統分子設計的思維邊界,其獨特的結構賦予了蛋白質新的物理化學性質與生物功能,極大地增強了人類深入理解、精確調控甚至理性設計生命體的能力。非天然氨基酸對于藥物開發也極為重要。據統計,美國食品藥品監督管理局(FDA)批準上市的兩百種最暢銷藥物中,具有非天然氨基酸單元的分子實體占比已經達到12%,充分展現該類結構單元對于生命活動調控的重要的功能。由于非天然氨基酸通常缺乏自然的合成體系,從微生物資源寶庫中挖掘、理解并利用酶,進而發展非天然氨基酸的高效生物合成路徑成為了這一領域的重大機遇與挑戰。 

  在生物合成路徑的設計領域,“生物逆向合成”是近年來被廣泛應用的一種設計方法。該方法采用反向的邏輯思維方式:從剖析目標產物的化學結構入手,根據分子中各原子間連接方式的特征,綜合考慮微生物催化元件的反應類型,選擇合適的化學鍵進行切斷,將目標分子分解為生物系統中易得且可被拼接或轉化的結構單元。據此理念指導,非天然氨基酸可以被切割為羧酸與胺分子兩個部分。而促成二者直接結合的氫胺化碳氮成鍵酶促反應,具備極高的原子經濟性,被視為合成非天然氨基酸的最優途徑。然而微生物體系中氫胺化酶極為稀缺,自上世紀三十年代以來,僅有寥寥數種氫胺化酶被發現。這些氫胺化酶在功能呈現出高度的專一性,極大限制了生物氫胺化反應的合成譜系,也使得酶分子進化舉步維艱。這種功能高度專一的分子表型背后的決定構效機制是什么?氫胺化酶嚴格的選擇性又是否具有調控空間?這是微生物酶學領域長久以來懸而未決的科學問題。 

  面對這些問題與挑戰,中國科學院微生物研究所吳邊團隊于20215月在Nature Catalysis以封面文章報道了他們關于蛋白質大尺度計算重設計構筑微生物非天然氨基酸合成平臺的突破性研究成果。該團隊使用實驗室建立的酶計算設計平臺,以源自芽孢桿菌的高特異性氫胺化酶為研究對象,精確刻畫出酶活性中心與底物之間形成的復雜氫鍵立體網絡,在原子尺度闡明了該酶的反應機理與專一性機制。進而重構了完整的酶活性中心,打破了生物體系內氫胺化反應非天然底物無法兼容的瓶頸,成功創造出超廣譜微生物氫胺化反應路徑,為合成生物學所需的新型底層生命砌塊創造了平臺制備體系。 

 

  1:微生物氫胺化酶的機制解析與計算重塑 

    

  在前期工作的基礎上,吳邊研究團隊提出了針對氫胺化酶的設計原則。第一,需保證烯酸及胺分子的底物通道不受結構改造影響,并確保底物進入活性位點后能保持對映選擇性的催化構象。其次,氫胺化酶活性位點具有縱橫交錯的氫鍵網絡,對局部相互作用的調整需同時兼顧親和性和特異性。最后,在緊湊的活性位點微環境內(活性位點平均體積僅為1072 ?3)進行大尺度改造,涉及到的突變組合路徑極為龐大,還需要充分考慮多位點突變的協同效應。 

  在這些設計原則的引導下,該團隊對天冬氨酸酶活性中心的氫鍵網絡進行了分割處理,描繪了近似反應態幾何尺度限定模型,通過蒙特卡洛隨機序列空間掃描的計算方法對非催化依賴的氨基酸殘基進行功能重設計。研究人員使用基于能量函數以及動力學模擬過程中近似反應態幾何尺度約束頻率的一致性評分結果對重設計蛋白進行虛擬篩選,進一步優化了計算設計文庫。團隊對通過虛擬篩選后的最終設計蛋白進行實驗表達驗證,成功獲得了一系列能夠催化交叉底物的人工非天然氨基酸合成酶。利用這些人工重構的微生物氫胺化反應元件,團隊進一步構建出可用于生產的工程菌株,實現了數十種非天然氨基酸的綠色合成,底物濃度達到150 g/L,實現了99%轉化率,99%區域選擇性,99%立體選擇性,時空產率達到131 g/L/h,相關指標達到了工業化生產的標準。 

 

  2:微生物催化的非天然氨基酸合成 

  伴隨著計算生物學、基因組學及人工智能的迅猛發展,蛋白質的計算解析與設計方向出現了諸多重大突破。新酶設計已突破傳統理性設計方法僅對結構進行微小擾動的桎梏,逐步邁向活性位點大尺度協同突變的功能重塑,乃至全局序列空間搜索的從頭設計。該項工作在微生物酶學領域率先實現了雙底物耦合設計的突破性創新,展示了計算工具在解析生物復雜科學問題中所能發揮的巨大作用,以及前沿技術對于賦能傳統微生物資源的重要意義 

  目前安徽華恒生物科技股份有限公司依托該項技術,已經投產千噸級的非天然氨基酸微生物酶法生產線,并順利運行至今。華恒生物作為合成生物學領域的代表企業,于20214月在科創板成功上市。隨著算法成熟度的提高,數據驅動的微生物酶學研究將為微生物產業的發展提供更有力的支撐。 

  本文通訊作者吳邊研究員自2018年獲得國家優秀青年科學基金項目資助開始微生物碳氮成鍵酶的機制解析與功能重塑研究,現為微生物資源前期開發國家重點實驗室副主任、國家重點研發計劃項目首席科學家。中國科學院微生物研究所助理研究員崔穎璐博士、研究助理田文雅與新疆石河子大學研究生王穎慧為本文共同第一作者。該工作得到了國家優秀青年科學基金項目、國家重點研發計劃合成生物學專項、中國科學院前沿科學研究計劃“從01”原始創新項目的支持。 

  文章鏈接:https://doi.org/10.1038/s41929-021-00604-2 

 

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