塑料工業已逐漸發展為國民經濟的支柱產業，在給人類社會的生活、生產帶來方便的同時，也導致大量的廢舊塑料垃圾不斷產生。由于其固有的硬度、強度、耐用性及穩定性需求，廢棄塑料制品無法自動降解，長期暴露對環境造成嚴重危害。目前塑料垃圾的處理方式通常是填埋和焚燒，這種“生產-廢棄-處理”的單向過程既不符合循環經濟的理念，也無法從源頭解決“白色污染”問題。
2004年，英國普利茅斯大學的 Richard C. Thompson 等人在《Science》雜志發表短文，提出了“微塑料”的概念。大量不可降解的微小塑料碎片（~20 μm）在環境中逐步轉移到土壤和海洋，最終進入生態圈和食物鏈，被包括人類在內的生物攝入，威脅人類健康和動植物的生存，發展綠色生物降解策略已成為生態、環境等領域發展的迫切需求。2016年，日本京都工藝纖維大學的Kohei Oda團隊在《Science》雜志報道了首個可以在30oC下可有效降解低結晶度PET塑料的IsPETase降解酶。然而，該酶穩定性極差，并不能滿足生物降解實際應用需求。
近日，中國科學院微生物研究所的吳邊團隊提出了一種提出新型蛋白質穩定性計算設計策略（greedy accumulated strategy for protein engineering, GRAPE）（圖1），基于計算機蛋白質設計對IsPETase進行了穩定性改造，獲得了魯棒性顯著增強的重設計酶，為拓寬生物降解塑料的應用場景提供了新思路。
圖1. GRAPE 策略示意圖
該團隊首先采用融合策略，綜合使用四種不同的單點預測算法輔以結構缺陷分析，預測了85個潛在有益突變。隨后，他們對預測突變進行了實驗檢驗，獲得了21個有益單點突變（ΔTm ≥1.5°C）。通過K-means聚類算法，作者將21個有益單點突變分為3個Cluster，并依據貪婪算法（圖2）對每個Cluster進行迭代疊加。
圖2. 貪婪算法示意圖
經過10輪迭代疊加，作者成功獲得熔融溫度提高31°C的IsPETase突變體（命名為DuraPETase）。在溫和條件下，DuraPETase對30%結晶度PET薄膜的降解效率相較于野生型提升了300倍（圖3B）。通過掃描電鏡可觀察到，經DuraPETase處理后的PET薄膜內部結構發生了顯著的腐蝕變化（圖3D）。
隨后，作者對DuraPETase蛋白晶體結構進行解析（圖4），驗證了突變體活性位點區域氨基酸之間協同相互作用，探究了DuraPETase性能改善的分子機制。值得注意的是，該項研究實現了2 g/L微塑料在溫和條件下的完全降解，為廢水中微塑料的預處理提供新的處理思路。
圖4.（a）W159H，（b）I168R-S188Q，及（c）S214H-L117F-Q119Y突變的結構分析，黃色、綠色、藍色分別代表野生型IsPETase，DuraPETase晶體結構及DuraPETase的分子動力學模擬軌跡構象
GRAPE策略的優勢在于運用聚類算法和貪婪算法，對計算獲得的有益突變體進行系統聚類分析再結合貪婪算法進行網絡迭代疊加，大幅規避了不同突變位點間的負協同相互作用，在較短時間內最大限度的探索序列空間疊加路徑。該項研究為計算機輔助蛋白質改造提供了新思路，也為進一步了解和推進自然環境中的聚酯水解提供了有價值的工具。近期這一成果發表在《ACS Catalysis》雜志上，并被評選為當期封面文章。中國科學院微生物研究所助理研究員崔穎璐及博士研究生陳艷春為論文共同第一作者，吳邊研究員為通訊作者。微生物研究所向華研究員、唐雙焱研究員、杜文斌研究員；天津工業生物技術研究所劉衛東團隊；中科大劉海燕團隊；南京大學梁勇團隊以及加州大學Houk教授為該工作的完成提供了重要的指導與幫助。
該研究得到了國家自然科學基金委員會與歐盟合作項目《合成塑料降解轉化微生物菌群》、國家重點研發計劃、國家自然科學基金優秀青年項目和面上項目、中國科學院戰略生物資源服務網絡計劃生物資源衍生庫項目、以及北京市自然科學基金項目的支持，并獲得了諾維信公司的寶貴技術支持和幫助。
文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.0c05126
