青霉素的故事

(1)青霉素的發現
   1928年英國人弗萊明(A.Fleming)在培養葡萄球菌的平板培養皿中發現,在污染的青霉菌周圍沒有葡萄球菌生長,形成一個無菌圈,后來人們稱這種現象為抑菌圈。他認為這是由于青霉菌分泌一種能夠殺死葡萄球菌或阻止葡萄球菌生長的物質所致,他把這種物質稱為青霉素。但是,弗萊明的這一重要發現在當時并沒有引起人們的重視。既然青霉素可以殺死葡萄球菌,就有可能殺死能使人致病的細菌,直到1940年,英國的病理學家佛羅理(H.W.Flory)和德國的生物化學家錢恩(E.B.Chian) 通過大量實驗證明青霉素可以治療細菌感染,具有治療作用,并建立了從青霉菌培養液中提取青霉素的方法。隨后醫生第一次用青霉素救治一位患敗血癥的危重病人,使當時無法治療的敗血癥病人恢復了健康。于是青霉素一時成了家喻戶曉的救命藥物,當時的價格比黃金還要貴。這三位科學家的發現,使青霉素進入了人類生活,挽救了成千上萬人的生命,使人類與疾病的斗爭進入了一個全新的時代,為增進人類的健康做出了巨大貢獻。為此,他們三人共同獲得了1945年的諾貝爾生理和醫學獎。
(2)新產業的誕生
   第二次世界大戰的爆發,造成大量傷員,急需大量的青霉素進行救治。促使英國和美國的科學家對青霉素的制造進行了大量的艱苦研究,在1945年實現了青霉素的工業化生產。最早采用的是固體表面培養法,即將固體培養基與青霉菌菌種液體混合,放入淺盤中,再將盛有發酵物的淺盤擺放在室內的架子上,保持室內溫度,進行發酵,發酵結束后,用水將產生的青霉素由固體培養基中浸提出來,制成干粉。使用這樣的生產方法存在許多問題。為了獲得足夠量的青霉素,需要大量的培養基和培養室,占用的廠房非常大,這也使溫度很難控制;并且勞動強度非常大,工人十分辛苦。更重要的是在發酵過程中,為了通風,培養基幾乎是暴露在空氣中,空氣中的各種微生物都會造成大量污染,無法做到純種發酵,使得每一次的發酵結果都不相同,很難控制發酵過程和質量。象這樣的問題還有很多,使當時的表面培養法生產青霉素的水平很低,發酵酵價只有40單位/毫升,收率只有20??產品純度為20??這樣的產品很難作為藥物使用,而且成本很高。它迫使人們研究新的生產方法。改變固體表面培養,而采用液體深層培養。所謂液體深層培養是指與固體表面培養相反,使用液體培養基在固定的容器內通入無菌空氣進行培養發酵的方法。為了實現液體深層培養,必須解決各種技術難題,如為了保證發酵過程不被其他微生物污染,防止其他微生物與產生青霉素的青霉菌爭奪營養,產生有害物質,影響青霉素的產生,一定要進行純種青霉菌的發酵。首先在發酵開始前,要對培養基和有關的整套發酵設備,如管道、閥門、取樣器、空氣過濾器等進行滅菌,把所有的微生物全部殺死;最簡單的方法是通入高溫蒸汽,加熱到100℃以上,保持一定時間后,冷卻到室溫后后再接入純的菌種進行發酵。為了在發酵過程中不使外界的微生物進入發酵設備內引起污染,要求發酵設備,如發酵罐、管道、閥門等必須密封;由于青霉菌在發酵過程中生長和產生青霉素均需要氧氣,因此,在發酵過程中要不間斷地向發酵罐內的發酵液中通入空氣,以供給足夠的氧氣。但是,如果通入的空氣中含有微生物,就會發生污染,使發酵失敗。因此,通入的空氣必須是無菌的。為了保證這一點,空氣要進行無菌處理,如過濾,滅菌等,就需要一系列的設備和方法。為了使通入的空氣中的氧氣溶解在培養基中,及時地供給菌體使用,就需要在發酵罐內設置攪拌裝置以及增加攪拌效果的擋板,使氣液充分混合,將氣泡打碎,增加氣泡與培養基的接觸,使氧氣及時的溶入培養基,及時地供給菌體。為了增加氧在培養基中的溶解度,一般要增加發酵罐內的壓力,通常罐壓要維持在0.01-0.05ps。維持一定的罐壓還有另一個好處,因為發酵罐需要攪拌,攪拌軸與罐外動力連接的軸承和密封圈的密封度有限,如果罐內壓力小于罐外,外面空氣會很容易進入罐內,造成污染;如果罐內壓力大于罐外,就可以起到防止外面空氣進入罐內,解決污染的問題。為了對培養基、發酵設備進行滅菌和控制發酵過程的溫度,發酵罐體均有可通入蒸汽、熱水或冷水的夾套,在發酵罐內有螺旋管。如為保證純種培養、培養基和通入的空氣要先滅菌、防止將雜菌帶入培養基中,發生污染;通入的空氣要盡快與培養基混合,使氧氣溶入培養基供細胞使用,為此需要進行攪拌混合;微生物生長和產生青霉素均需要適當的溫度,控制溫度成為關鍵,如此等等。還有與之有關的技術問題,設備問題和工藝問題都需要解決。為此人們研究開發了可通入無菌空氣、利用夾套和冷熱管通入冷熱水控制溫度的密封攪拌式發酵罐,以及配套的其他設備,如空氣壓縮、過濾、滅菌設備,以及相應的生產工藝和技術。利用這樣的發酵罐設備、工藝和技術,再配以離心、溶媒萃取和干燥等技術,使青霉素的生產水平提高到發酵效價每毫升200單位,提取收率75??產品純度為60??使發酵所需的廠房占地面積、勞強度、能源消耗、原材料、成本等大大降低,為青霉素在臨床上的大量使用奠定了基礎。

   在半個多世紀里,人們利用各種傳統的遺傳學方法對產生青霉素的菌種進行大量的改造,不斷改進培養基和發酵條件,不斷地完善發酵設備及有關設備,對發酵工藝控制等方面作了大量工作,使青霉素的生產水平不斷提高。特別是進十年來,人們對青霉素在微生物中的合成路線和相關的代謝途徑進行了全面研究,發現了控制和調節青霉素合成和代謝的許多“閥門”,人們利用各種手段來調節和控制這些“閥門”,使微生物按著人們要求的青霉素合成路線大量地生產青霉素。特別是隨著基因工程的發展,利用基因工程將青霉素生物合成過程中起“開關”或“閥門”作用的關鍵酶的基因克隆到生產菌種中,加大對青霉素合成路線的控制力度,即進行代謝調控,控制發酵過程盡可能的利用原材料,減少副產物的產生;通過對影響青霉素發酵的各種因素,主要是外部因素,如培養基組分,通氣量,攪拌速度,罐壓,發酵液中的溶解氧,溫度,pH等,以及對青霉素發酵動力學的深入研究,建立了有效的發酵動力學模型,采用流加發酵和變溫發酵技術,利用計算機進行發酵過程控制,對碳源、氮源、前體、pH、攪拌速度、通氣量、罐壓、溫度和溶氧等諸多參數進行自動檢測和關聯控制,使青霉素的生產水平不斷提高。幾乎是每十年青霉素發酵水平翻一翻,生產規模不斷擴大,發酵罐容積不斷擴大,現在工業上使用的發酵罐已達到500立方米。發酵效價已經達到7-9萬單位/毫升發酵液,在小型發酵罐上發酵效價已達到9-10萬單位/毫升發酵液,發酵效價幾乎提高近2500倍。在產品分離純化技術也有了大幅度的提高,收率達到90??產品純度在99.9?¥上。除了遺傳,基因工程育種大幅度提高菌種的生產能力以外,更重要的是由于發酵工程的進步,使工藝技術、工程設備、檢測控制等多方面發生了重大變化,使青霉素的工業生產達到了前所未有的水平。因此可以說,發酵工業的技術進步得利于生物技術的全面發展,與發酵工程的發展有著更為直接的關系。

(3)先行者
   繼青霉素的發現和在臨床上的應用,為人們尋找新的藥物開辟了新的思路和途徑。1944年瓦克斯曼(Waksman)從灰色鏈霉菌中發現了鏈霉素,開辟了利用放線菌生產抗生素的途徑。隨后在微生物中發現了許多具有殺滅和抑制其他微生物發育和代謝,有的還可抑制腫瘤細胞的發育和代謝的生物活性物質,現在人們將之統稱為抗生素,具有抗微生物作用的抗生素又稱為抗菌素。青霉素的液體深層發酵技術和設備的工業應用及新的抗生素的不斷發現,使抗生素工業迅速發展。上個世紀的60-80年代是抗生素研究發展的高峰年代,到目前為止從微生物中發現的抗生素有近2000多種,在工業上生產并在臨床上應用的抗生素有近100種。
   為適應青霉素生產而研究開發的液體深層發酵技術和設備,徹底改變了傳統的固體發酵,這些技術和設備逐漸地推廣應用到其它的發酵產品的生產上,也取得了領人滿意的結果。因此,用于青霉素生產的技術和設備的研究開發為現代的抗生素工業和現代發酵工業的建立和發展奠定了基礎。
(4)魔高一尺道高一丈
   在上個世紀的五十年代,也就是青霉素開始大量在臨床上使用時,一個病人每一次注射青霉素只需要20萬單位,而到了九十年代,一個病人每一次注射的青霉素需要80-100萬單位,青霉素用量幾乎增加了近5倍。為什麼在不到半個世紀里,病人需要注射的青霉素用量增加了近5倍,是不是如人們所說的現在的青霉素質量不如從前了呢!不是的。現在生產的青霉素質量不僅不比從前生產的青霉素質量差,反而還有大幅度的提高。其主要原因是由于人們長期、大量使用青霉素,特別是不科學的大量濫用青霉素,如低劑量長期使用,使許多致病菌對青霉素產生了耐藥性,有些致病菌不僅能夠耐藥,還可以破壞青霉素,很快使青霉素喪失殺菌活性。因此,不得不增加青霉素的用量,以保證治療效果。
   對青霉素殺菌治病機理的研究發現,青霉素主要是抑制細菌細胞壁的形成。這正如把一只小兔子的皮剝掉,小兔子就不能夠活一樣。細菌細胞壁被破壞,細菌就不能夠繁殖,從而達到抑制和治病的效果。在研究青霉素的化學結構與藥效關系中,發現在青霉素分子由兩部分組成,一是有由一個四元環與一個五元環并在一起所組成的分子活性部分,稱為“母核”,它是青霉素抗菌活性的關鍵部分,如果四元環被破壞而打開,青霉素就失去了抗菌活性;另一部分是與之連接的側鏈。研究發現改變側鏈的結構,可以使母核穩定,增加耐受致病菌破壞的能力。同時還可以擴大抗菌譜,增加耐酸性,使之可以口服,在一定程度上也可以減低過敏性。因此,通過對青霉素的結構改造,達到提高青霉素藥效和治療作用,具有巨大的臨床應用價值。
在以前人們使利用化學方法將青霉素母核上的側鏈‘切下’來,獲得母核,然后再經化學方法給母核接上一個新的側鏈,得到的是經過改造的‘半合成青霉素’。致病菌對經過改裝的青霉素的破壞和耐受能力降低,容易被殺死。過去病人打一針普通青霉素要80-100萬單位,而現在打半合成青霉素,如氨芐青霉素,羥氨芐青霉素,只需要20萬單位,就可以達到同樣的治療效果。
   但是,用化學方法來生產青霉素母核很困難,需要在很低的溫度下進行反應,一不小心,可能就會失敗,拿不到一點產品。在上個世紀的五十年代末期,人們在微生物中發現了一種能夠將青霉素的側鏈‘拆下來’得到青霉素母核的一種酶,就給它起名叫做青霉素酰化酶。但是并未引起人們注意。直到上個世紀的七十年代,半合成青霉素的發展需要大量的青霉素的母核,而使用化學方法生產青霉素母核遇到許多困難時,才想到青霉素酰化酶,開始進行大量研究,并獲得了成功。

   使用產生青霉素酰化酶的大腸桿菌細胞(因為酶在細胞內)可以將青霉素的側鏈切掉,獲得母核。后來發現其它一些細菌產生的青霉素酰化酶是在細胞外的發酵液里,人們稱之為胞外酶,因為產量高,比較容易分離得到而受到人們的重視。但是不論是胞內還是胞外的青霉素酰化酶在工業上使用有許多缺點。比如使用細胞作為酶源時,在使用過程中細胞會破壞,由細胞釋放出來的許許多多東西會跑到反應液中,即使細胞不破壞,從反應液中出去細胞也比較麻煩;使用酶時,因酶是水溶性的,它催化反應完了還留在反應液里,使得產物分離有一定困難,容易污染產物;另外,酶催化反應結束后,酶并未完全喪失催化能力,往往還可以再使用,但是因為溶解在水里,很難把酶分離出來再使用。費了很大力氣生產的酶只使用了一次,就丟掉了,十分可惜。所以發展了固定化技術,將產胞內青霉素酰化酶的細胞用適當的材料包埋成小珠,制成固定化細胞,或將青霉素酰化酶結合在特殊的高分子材料上,制備成固定化酶。裝在下底有過濾網的攪拌罐式反應器中,加入10??青霉素溶液和適當量的固定化酶或固定化細胞,保持溫度35-40℃左右,并通過pH自動控制儀流加堿液,保持反應液的pH在8.0-8.5,當反應結束,加入酸將反應液的pH調到弱酸性,用醋酸乙酯提取產生的苯乙酸,經適當濃縮后,產生的青霉素母核-6-APA既可結晶出來。也可以將固定化酶或固定化細胞裝在柱式反應器中,將青霉素溶液從柱反應器的一端以較高的流速進入,從另一端流出,在儲罐中通過pH自動控制儀流加堿液,保持反應液的pH在8.0-8.5,反應結束后利用上述方法獲得青霉素母核。利用這樣的設備可以進行批式或連續生產,容易實現自動化和連續化,反應結束后,因為酶是固體的,很容易與反應液分開,酶不會污染產物;酶也可以反復再用,這使得青霉素母核的生產變得比較輕松,可以大幅度的降低生產成本,提高產品質量。為青霉素母核的生產開辟了一種全新的生產方法,克服了化學方法的缺點,如生產不穩定,搞不好會得不到產品,要吃零蛋的危險;提高了產品質量和產量,降低了生產成本,解決了環境污染等問題。
   有了青霉素母核接上一個新的側鏈,就成為半合成青霉素。在上個世紀九十年代以前,都是使用化學法合成。但早在七十年代就發現青霉素酰化酶不僅可以催化青霉素水解產生母核,也可以催化母核與新的側鏈反應合成半合成青霉素。其與生產青霉素母核的反應條件不同,生產母核的反應是在弱堿性條件,而合成反應是在弱酸性和有新的側鏈的衍生物存在下進行。現在利用青霉素酰化酶催化合成氨芐青霉素已經獲得成功,但還不能象化學合成方法那樣可以用于合成各種半合成青霉素。
   半合成青霉素,從上個世紀六、七十年代的第一代已發展到現在的第四代,我國醫院大量使用的氨芐青霉素,羥氨芐青霉素是第三代產品。

5)孿生兄弟—頭孢霉素
   很早以前就發現,在使用青霉菌發酵青霉素時,發酵液中多多少少的還同時有與青霉素類似的另一種抗生素,頭孢霉素。它們在結構上有許多相似之處,均由類似的母核與側鏈組成。不同之處是側鏈結構有差別,青霉素母核的五元環在頭孢霉素母核上為六元環。它們是青霉菌產生的孿生兄弟。
-- 合成第三代頭孢霉素分子式 --

   在青霉菌發酵時,在合成的開始階段青霉素和頭孢霉素有共同的前體,不久出現分支,在分支點上,有一個重要的“調節閥門”,叫做擴環酶,母核的五元環不擴大,直接走下去進入了青霉素合成,如果擴大成為六元環,進入頭孢霉素合成。因此,現在人們利用基因工程方法,增加擴環酶基因,相當于將“調節閥門”打開,同時利用基因工程方法使流向青霉素合成的基因“關閉”,使頭孢霉素的合成“流”加大,既可增加頭孢霉素的合成產量,同時大幅度的減少青霉素的合成。這也就是現在所說的代謝工程。青霉菌經過這樣的技術改造,可以在工業上大量生產頭孢霉素。
同樣頭孢霉素也可以將側鏈切掉,獲得母核,然后再接上一個新的側鏈,獲得半合成頭孢霉素。母核的生產可以使用化學方法,也可以使用酶工程方法。但與青霉素母核生產不同,因為它們的側鏈結構不同,頭孢霉素C的側鏈是氨基己酸,使用青霉素酰化酶不能夠將其切下,必須使用另外兩種酶將側鏈切下來,才能得到頭孢霉素母核。最近,從微生物中找到了頭孢霉素酰化酶,它可以直接將頭孢霉素的側鏈切下,獲得頭孢霉素母核。然后使用化學合成方法合成半合成頭孢霉素。
   在這之前,是使用化學擴環方法將青霉素的五元環擴大成六元環,得到側鏈與青霉素相同的頭孢霉素,然后利用青霉素酰化酶切去側鏈,得到與頭孢霉素母核略有不同的頭孢霉素母核,再用于生產半合成頭孢霉素。
   因為頭孢霉素比青霉素更穩定,可以口服,它的過敏反應低,抗菌譜廣,病菌的耐藥性小,在臨床上得到廣泛應用。為人類戰勝疾病又增加了一種有效的藥物。
   抗生素的家族,它們都能干些什麼,半個多世紀的風風雨雨。
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